28 просмотров
Рейтинг статьи
1 звезда2 звезды3 звезды4 звезды5 звезд
Загрузка...

Иммунный блот механизм практическое использование. Иммуноблоттинг — дополнительный непрямой метод. Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Механизм, ингредиенты иммуноблоттинга

Иммуноблоттинг (ИБ) — высокочувстви­тельный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА. Смесь антигенов микроорганизма (родовых, видовых, групповых) разделяют на фракции, содержащие отдельные антигены с помощью электрофоре­за в полиакриламидном геле. Затем переносят его (блоттинг ¾ от англ. blot, пятно) из геля на нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блоттами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове­ка, меченую ферментом. Образовавшийся на полоске комплексы антиген + антитело больно­го + антитело против Ig человека, меченое ферментом, выявляют до­бавлением субстрата и хромогена, изменяющих окраску под действием фермента. ИБ используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции, сифилисе, листериозе и других инфекциях.

6. Механизм, ингредиенты иммунной электронноймикроскопии (ИЭМ)

Иммунная электронная микроскопия ¾ электронная микроскопия микробов, чаще вирусов, обработанных соответствующими антителами. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов образуется «венчик» из антител, контрастированный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электронно-оптически плотными препаратами. То есть этот метод представляет собой непосредственную визуализацию взаимодействия антигена и антител методом электронной микроскопии.

Методически тест ИЭМ выполняется в следующей последовательности:

1. Материал, в котором предполагается наличие искомого вируса, смешивается и инкубируется со стандартной иммунной сывороткой.

2. Комплекс вирус-антитело осаждается центрифугированием в подходящих для него режимах.

3. К ресуспендированному осадку добавляется контрастирующее вещество, и полученный препарат исследуется под электронным микроскопом. В качестве данного вещества используется ферритин ¾ белок, содержащий до 23 % железа, хорошо контрастирующий и поэтому применяющийся в качестве метки. После обработки мечеными АТ изучаемых объектов (вирусов, бактерий, срезов инфицированных клеток) они становятся электронноплотными и могут быть выявлены при электронной микроскопии.

В случае положительной реакции выявляются характерные агрегаты, состоящие из вирусных частиц, соединенных между собой мостиками из антител. Порог чувствительности ИЭМ невысок: надежное выявление вируса осуществимо, когда его концентрация в исходном материале составляет 10 4 -10 6 частиц в мл. Преимуществом метода является возможность оценивать не только исход серологической реакции, но и идентифицировать ее морфологический субстрат, т. е. определить форму и размер вирусных частиц. При наличии препаратов вируса с известным содержанием частиц ИЭМ может применяться и для количественного определения антител в сыворотках, для чего предложена специальная система учета интенсивности взаимодействия вируса и антител.

Современные тест-системы для серологической диагностики дают возможность определять не только суммарные антитела (антитела одной специфичности, принадлежащие к разным классам иммуноглобулинов), но и отдельно специфические IgG, IgM, IgA.

Таблица 30. Интерпретация результатов, основанных на определении комбинации IgG, IgM, IgA

Справочник Эколога

Здоровье твоей планеты в твоих руках!

Иммуноблоттинг принцип метода

Иммуноблоттинг –(от англ. «blot» – пятно) – метод идентификации антигенов (или антител) с помощью известных сывороток (или антигенов). Представляет собой сочетание гель-электрофореза с ИФА. Первоначально бактериальные клетки или вирионы разрушают при помощи ультразвука, а затем методом электрофореза разделяют все антигены вируса или бактериальных клеток и получают коммерческий реагент на специальной нитроцеллюлозной плёнке. При постановке иммуноблоттинга на плёнку с известными антигенами наносится исследуемая сыворотка пациента. После инкубации и отмывания несвязавшихся антител, приступают к ИФА – на плёнку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов антиген-антитело-антисыворотка к иммуноглобулину-фермент на носителе появляются окрашенные пятна. Метод иммуноблоттинга позволяет отдельно обнаружить антитела на различные антигены возбудителя (например, при ВИЧ-инфекции иммуноблоттинг выявляет антитела на gp120, gp24 и другие антигены вируса).

Радиоиммунный анализ (РИА)

В основе метода лежит реакция антиген-антитело с применением метки антигена или антитела радионуклидом. В качестве метки используются 125I, 14C, 3H, 51Cr и другие радионуклиды. Образующиеся иммунные комплексы выделяют из системы и определяют их радиоактивность на счётчиках (β-излучение). Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Читать еще:  Какие виды аппендицита бывают

Широко распространён твёрдофазный вариант РИА с использованием меченых антител или антигенов, сорбированных в лунках полистироловых панелей.

РИА применяют для выявления антигенов микробов, вирусов, различных гормонов, ферментов, лекарственных веществ, иммуноглобулинов, а также других веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях 10-12–10-15 г/л.

Контрольные вопросы

Реакция иммунного бактериолиза: что это за реакция; что является антигеном, что – антителами, механизм реакции, методы постановки, практическое применение. Реакция иммунного гемолиза: необходимые ингредиенты, методика постановки; контроли, практическое применение. Реакция локального гемолиза в геле (реакция Йерне): принцип реакции, методика постановки, практическое применение. Реакция связывания комплемента: принцип реакции; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии? Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? С помощью какой реакции можно определить, что произошло с комплементом; почему используется именно эта реакция; каков видимый положительный результат РСК? Почему? Какое свойство комплемента используется в первой фазе РСК? Во второй фазе? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает – положительный или отрицательный результат? Объясните результаты: РСК+ + + +, РСК+ + +, РСК+ +, РСК+. Назовите ингредиенты первой системы РСК и ингредиенты второй системы РСК. Почему исследуемую сыворотку необходимо инактивировать? Как титруют комплемент? Гемолитическая сыворотка: что она содержит, как её получают, что такое титр и как его определяют? Какие животные используются для получения компонентов РСК? Методика постановки РСК на холоде. При постановке каких из перечисленных реакций необходимо участие комплемента: преципитации, флоккуляции, агглютинации, выявления неполных антител, иммунного бактериолиза, иммунного гемолиза, Йерне, РСК? Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – укажите последовательность событий при прямой реакции Кунса; необходимые ингредиенты. Что является антигеном, что – антителами, чем помечены антитела, как учитывается результат реакции, как выглядит положительный результат? Практическое применение – что можно определить с помощью этой реакции? Непрямая реакция иммунофлюоресценции – укажите последовательность событий при этой реакции, необходимые ингредиенты, что является антигеном, какие иммунные сыворотки применяются; практическое применение; преимущество непрямой РИФ по сравнению с прямой реакцией. Иммуноферментный анализ (ИФА) – принцип реакции; необходимые ингредиенты; укажите последовательность событий при постановке реакции с целью обнаружения антигена в исследуемом материале; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате, как он выглядит? Укажите последовательность действий при постановке ИФА с целью обнаружения антител в исследуемой сыворотке; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате? Иммуноблоттинг – принцип реакции; основные этапы; необходимые ингредиенты; как учитывается результат; преимущества реакции. Радиоиммунный анализ (РИА) – из каких основных этапов складывается реакция; чем помечены антитела или антигены, как учитывается результат? Иммуноэлектронная микроскопия – принцип метода; основные этапы; необходимые ингредиенты; чем помечены антитела; как учитывается результат реакции. Реакции иммобилизации – принцип метода, техника постановки, компоненты, учёт результатов.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки.

Заполните таблицу «Реакции иммунитета» в отношении реакций, разбираемых в рамках данной темы.

Иммуноблоттинг — дополнительный непрямой метод

Иммуноблоттинг — дополнительный непрямой метод

Кроме ИФА в определенных случаях для тестирования ВИЧ-инфекции используют процедуру, называемую «иммуноблоттинг» или «иммунный блоттинг» (иногда называют еще «вестерн-блот»). По рекомендации ВОЗ иммуноблотинг используется при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве дополнительного экспертного метода, который должен подтверждать результаты ИФА. Обычно этим методом перепроверяют положительный результат при ИФА, поскольку он считается более чувствительным и специфичным, хотя более сложным и дорогим. Но прежде чем подписать окончательный приговор пациенту, врач должен убедиться полностью в правильности диагноза. Поэтому вопрос о сложности и дороговизне здесь не может быть решающим.

Как по назначению, так и по способу исполнения к иммунному блоттингу хорошо подходит известное выражение «вывести на промокашку». Иммунный блоттинг сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим разделением белков вируса в геле и их переносом на нитроцеллюлозную мембрану («промокашку»). Процедура иммуноблота состоит из нескольких стадий (рис. 27). Сначала предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов ВИЧ подвергается электрофорезу, при этом все входящие в состав вируса антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на «промокашку» избытка чернил) антигены переносят из геля на полоску нитроцеллюлозы или нейлонового фильтра, которые отныне содержат невидимый пока глазом спектр белков, характерный для ВИЧ. Далее на стрип наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т. п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им полосками белков-антигенов. В результате последующих манипуляций (подобных ИФА) результат этого взаимодействия визуализируется — делается видимым. В конечном итоге наличие полос на определенных участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определенным антигенам ВИЧ.

Читать еще:  Проект «Секреты здоровья. Презентация на тему "секреты истинного здоровья" Презентация на тему секреты здоровья

Иммунный блоттинг чаще всего используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции. ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (gp160, gp120, gp41) в сочетании или без реакции с другими белками результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование с использованием набора другой серии или другой фирмы. Для подстраховки, если

Рис. 27. Для проведения иммуноблотинга на первом этапе белки, содержащиеся в сыворотке крови, разделяют в геле по их молекулярной массе и заряду с помощью электрического поля (методом электрофореза в геле). Затем на гель накладывают нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану и «промокают» (это и есть блоттинг). Это осуществляют в специальной камере, которая позволяет осуществить полный пернос материала из геля на мембрану. B результате та картина расположения белков, которая была на геле, воспроизводится на мембране (блот), с которой можно далее легко манипулировать. Первоначально мембрану обрабатывают антителами к искомому антигену, а после отмывки несвязанного материала добавляют радиоактивно меченный коньюгат, который специфически связывается с антителами (как в ИФА). Местоположение образующегося комплекса «антиген-антитело — меченый коньюгат» определяют с помощью авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. После ее проявления становится ясным, есть ли антигены в крови или их нет и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется последующее наблюдение в течение шести месяцев (исследования продолжаются через каждые три месяца).

B настоящее время в РФ для использования при диагностике ВИЧ-инфекции рекомендовано использовать пять тест-систем, среди которых имеются как российские, так и зарубежные.

Иммуноблоттинг на ВИЧ – как проводится, расшифровка результатов

Иммуноблоттинг на ВИЧ – это один из методов диагностики инфекции иммунодефицита. Подчеркнем – один из методов. Да, это высокоточный метод, но в большинстве случаев он применяется как “истина в последней инстанции”.

Диагностические процедуры чаще всего начинаются с ИФА. В случае сомнений в результатах может быть назначена процедура иммунного блоттинга. В любом случае иммуноблоттинг входит в диагностическую цепочку диагностики ВИЧ.

Метод сложный и дорогостоящий. По этой причине его применение обосновано в условиях неопределенности – то ли ставить диагноз, то ли он ложный.

Иммуноблоттинг – что это

Иммуноблоттинг – это методика лабораторных исследований сыворотки крови, позволяющая выявить наличие в крови специфических белковых соединений (антител).

Название метода происходит от английского Blot (пятно). В нашей медицине принят термин “блоттинг”. Поскольку метод относится к сложной теме из молекулярной биологии, подробно его рассматривать не будем. Остановимся только на моментах, которые необходимы для понимания диагностической цепочки.

Справочно. Основным в иммуноблоттинге является выделение необходимых белков из сыворотки крови, нанесение их на носитель с последующим анализом. Чтобы выделенные белки увидеть, их, например, окрашивают в какой-либо цвет (отсюда и пятно).

Метод диагностики иммуноблоттинг применяется для определения различных заболеваний. В диагностике ВИЧ он проявил себя эффективно.

Как проводится

Для проведения иммунного блоттинга используют электрофорез исследуемых белковых структур в полиакриламидном геле. После того, как произойдет разделение изучаемых антигенов по молекулярному весу, полученный материал переносят на нитроцеллюлозные или PVDF мембраны.

На мембране остается спектр белков, характерный для исследуемого заболевания. После этого на мембрану наносят сыворотку крови пациента. В случае, если сыворотка содержит необходимые антитела, происходит реакция связывания типа антиген-антитело.

Связывание происходит строго по соответствующим полоскам антигенов на мембране. За счет этого становится возможна визуализация образовавшихся комплексов антиген-антитело.

При положительном анализе иммунного блоттинга появляются видимые полосы на определенных участках мембраны.

Также многие современные методики исследования иммуноблоттинга проводятся при помощи ИФА (иммуноферментный анализ) или иммуноокрашивания.

Для каждого конкретного исследования применяют специфичные к исследуемому белку антитела. За счет этого иммунный блоттинг относится к высокоточным исследованиям с низким уровнем погрешности.

Справочно. Иммуноблоттинг на ВИЧ используется для выявления в крови антител к вирусу иммунодефицита человека.

В некоторых лабораториях вместо классического иммуноблоттинга применяют линейную методику, относящуюся к непрямым иммунологическим исследованиям, позволяющим провести качественную оценку наличия аутоантител класса IgG.

ИФА и иммуноблоттинг на ВИЧ

Иммуноферментный анализ (ИФА) относится к лабораторным иммунологическим методам качественной или количественной диагностики в анализе крови специфических соединений (низкомолекулярные соединения, макромолекулы, вирусы).

В основе иммуноферментного анализа лежит реакция антиген-антитело.

При выявлении в анализе указанного комплекса (антиген-антитело) его отмечают с помощью специального фермента.

Читать еще:  Неходжкинской лимфомой 3 й степени. Лечение неходжкинской лимфомы. Неблагоприятные прогностические факторы

Иммуноферментный анализ достаточно прост в использовании и отличается высокой точностью. В связи с этим, при диагностике инфекции его применяют в первую очередь.

Однако, согласно протоколам диагностики, такой серьезный диагноз на основании результатов одного ИФА не выставляется. Для подтверждения требуется обязательное проведение иммуноблоттинга на ВИЧ.

Справочно. Это связано с тем, что иммунный блоттинг отличается максимальной точностью. При получении нескольких положительных результатов иммуноблоттинга вероятность диагностической ошибки сводится к нулю.

Следует отметить, что в отличие от ИФА, иммунный блоттинг относится к сложным и весьма дорогостоящим методикам диагностики, поэтому он применяется только после получения 2 положительных анализов ИФА.

Читайте также по теме

В отличие от ИФА, иммунный блоттинг не дает ложноположительных результатов при наличии у пациента антител к Эпштейн-Барр вирусу, ревматоидному фактору, главным комплексам гистосовместимости HLA, при беременности.

В каких случаях назначается анализ

Анализ на ВИЧ назначается:

  • при выявлении у пациента генитального герпеса, гонореи, сифилиса и других заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП);
  • после незащищенного полового контакта с непроверенным партнером;
  • после нанесения татуировок или татуажа, выполнения пирсинга или проведения инъекционных косметологических процедур в нелицензированных заведениях;
  • после контактов с кровью инфицированного человека;
  • после использования игл, бритв, лезвий или хирургических инструментов, загрязненных биологическим материалом ВИЧ-инфицированного пациента;
  • при плановом обследовании перед получением гражданства, вида на жительство, при прохождении комиссии в военкомате, при прохождении профилактического осмотра перед поступлением в медицинский университет, при плановых профосмотрах (военные, хирурги);
  • при планировании беременности;
  • во время вынашивания ребенка;
  • при выявлении у пациента симптомов ВИЧ инфекции.

Симптомы ВИЧ на первых стадиях не специфичны. Заболевание может проявляться слабостью, постоянной сонливостью, вялостью, периодической лихорадкой, мышечными и суставными болями, хроническими тонзиллитами, увеличением лимфатических узлов, сыпью неясной этиологии.

В редких случаях возможны постоянные головные боли, частая потеря сознания, снижение памяти, развитие энцефалопатии.

Прогрессирует инфекция медленно, поэтому подобная неспецифическая симптоматика может наблюдаться на протяжении от 3 до 7 (и более) лет.

В дальнейшем симптомы проявляются в виде оппортунистических инфекций (сопутствующие инфекционные заболевания, развивающиеся на фоне снижения иммунитета из-за прогрессирующего ВИЧ).

Максимальная эффективность лечения достигается на стадии неспецифических проявлений. Поэтому, при наличии факторов риска заражения (инъекционная наркомания, частые незащищенные половые контакты с непроверенными половыми партнерами и т.д.) требуется регулярно проверяться на ВИЧ.

Иммуноблоттинг на ВИЧ – где сдать

Анализ на иммуноблоттинг можно пройти в центре СПИДа или частных лабораториях. По желанию пациента обследование может быть проведено анонимно.

Антитела к вирусу иммунодефицита человека появляются в крови зараженного человека уже через 2 недели после заражения.

Однако, для получения максимально точных результатов следует провести 2-3 теста на ВИЧ инфекцию. Чаще всего проводят обследование на 6 и 12 неделе после предполагаемого заражения.

Может быть проведено экстренное обследование (при возможности назначения ранней постконтактной профилактики).

Вероятность выявления положительного иммуноблоттинга на ВИЧ во многом зависит от времени, прошедшего от момента заражения.

Справочно. Через месяц после заражения анализ положителен у 60% пациентов, спустя 45 дней – у 80%, через 3 месяца антитела выявляются практически у 100% инфицированных.

В связи с этим, перед обследованием на ВИЧ требуется проконсультироваться с врачом СПИД-центра. Консультации проводятся анонимно. Специалист расскажет о том, как может передаваться вирус, как предохраняться от заражения, рассчитает срок, когда лучше пройти обследование и сколько раз необходимо сделать анализ.

Также по показаниям может быть назначена ранняя профилактика.

Результат иммуноблоттинга должен трактоваться исключительно специалистом. Самостоятельное назначение обследования в частном центре и расшифровка результатов «по интернету» может привести к диагностическим ошибкам и тяжелейшим последствиям для здоровья.

В СПИД-центре после анализа проводится послетестовая консультация. При выявлении положительного иммуноблоттинга врач назначает дополнительные обследования, на основании результатов которых пациенту подбирается комплексная антиретровирусная терапия.

Как проводится анализ на ВИЧ

Справочно. Согласно официальным протоколам диагностики ВИЧ-инфекции, в первую очередь проводится скрининговое исследование при помощи методики ИФА. Дальнейшая диагностика зависит от результатов первого исследования.

Если ИФА не выявил антител к ВИЧ и вирусных антигенов, обследуемому выдается отрицательный результат. Дальнейшее обследование не выполняется.

Исключение могут составлять случаи, при которых пациент не уверен в точных сроках предполагаемого инфицирования. Для уточнения может быть рекомендовано повторное прохождение теста через 6-12 недель (для исключения ложноотрицательных результатов).

При получении сомнительных или положительных результатов пациент получает направление на дальнейшее обследование в СПИД-центре. После этого проводится еще 1-2 анализа методом ИФА.

При получении двух положительных или сомнительных результатов проводится иммуноблоттинг на ВИЧ инфекцию.

Ссылка на основную публикацию
Статьи c упоминанием слов:
Adblock
detector